AMAÇ ve KAPSAM
Balda HMF miktarının Spektrofotometrik yöntemle belirlenmesidir.
PRENSİP
Bal numunesinde bulunan ve karbonhidratların ısıtılmasından oluştuğu bilinen hidroksimetil furfurol, para-toluidin ve barbitürik asit ile muamele edilerek renkli bir maddeye dönüştürülür. Oluşan renkli çözeltinin absorbansı spektrofotometrik olarak ölçülür ve buradan hidroksimetil furfurol muhtevası hesaplanır.
ALET EKİPMAN
•Genel laboratuvar malzemeleri
•Spektrofotometre 550 nm dalga boyunda ölçüm yapabilen , 1 cm lik ışın yollu.
•Hassas terazi
KİMYASALLAR
•Para-toluidin çözeltisi, 100 g/L'lik: 10,0 g para-toluidin, 50 mL izopropil alkol içinde, su banyosu üzerinde hafifçe ısıtılarak çözülür. Olabildiğince az izopropil alkol ile yıkanarak, 100 mL'lik bir ölçülü balona kantitatif olarak aktarılır. Çözeltiye 10 mL kristalize asetik asit katılıp karıştırılır. Hacim, izopropil alkol ile 100 mL'ye tamamlanır ve iyice karıştırılır. En az 24 saat dinlendirildikten sonra çözelti kullanıma hazır olur. Bu çözelti başlangıçta renksizdir; fakat kısa zamanda kahverengine döner. Renklenmesi kullanılmasına engel değildir, renkli ve iyi kapanan bir şişede muhafaza edilirse, 6 ay süreyle kullanılabilir. Ancak, ilk hazırlandığında, en az 24 saat dinlendirilmesi ve sonra kullanılması esastır.
•Barbitürik asit çözeltisi, % 0.5'lik: 0,5000 g barbitürik asit, 100 mL'lik ölçülü bir balonda, 60-70 mL suda çözülür. Hacim su ile işaret çizgisine kadar tamamlanır ve iyice karıştırılır.
•Oksijensiz damıtık su: Kaynar haldeki damıtık su içinden, oksijeni tamamen giderilmiş (% 0.01'in altına düşürülmüş) azot gazı geçirilerek suda çözünmüş halde bulunan oksijen uzaklaştırılır. Elde edilen oksijensiz su soğutulur ve ağzı hava sızdırmayacak şekilde kapanabilen bir kap içinde muhafaza edilir.
DİKKAT EDİLMESİ GEREKEN NOKTALAR: Bu tayinden önce bal, ön ısıtmaya tabi tutulmamalıdır. Para-toluidin'in ilk hazırlandığında, en az 24 saat dinlendirilmesi ve sonra kullanılması esastır. Deneyler en az iki paralel örnek üzerinde yapılmalı, deneylerde ve çözeltilerin hazırlanmasında damıtık su veya buna eşdeğer saflıkta su kullanılmalıdır.
İŞLEM
Deney Çözeltisinin Hazırlanması
Ön ısıtma işlemine maruz bırakılmaksızın hazırlanmış analiz numunesinden 10,0 g lık bir tartım alınarak 20 mL oksijensiz su içinde ısıtılmaksızın çözülür. Aynı su ile yıkamak suretiyle, 50 mL'lik bir ölçülü balona aktarılır. İşaret çizgisine kadar, yine oksijensiz su ile tamamlanır ve iyice karıştırılır. Bu numune, hazırlandıktan sonra, mümkün olan en kısa zamanda işleme alınmalıdır.
Renk geliştirme ve Fotometrik Tayin
A ve B tüplerine her birine, 2 'şer mL deney çözeltisi ve 5 'er mL para-toluidin çözeltisi konur. A tüpüne 1,00 mL su , B tüpüne 1,00 mL barbitürik asit çözeltisi katılır ve her iki tüp de iyice karıştırılır. Bu işlemlerin tamamı 1-2 dakika içinde tamamlanmalıdır. A tüpü spektrofotometrenin sıfırlanması için kullanılacak olan referans çözeltidir.
Spektrofotometre, 550 nm dalga boyuna ayarlandıktan sonra, referans çözeltisine ( A tüpü ) karşı absorbans değeri sıfırlanır. Sonra, deney çözeltisinin ( B tüpü ) absorbansı (A) okunur.
HESAPLAMA
Hidroksimetil furfurol miktarı (HMF), 1 kg balda mg olarak, aşağıdaki formüle göre hesaplanır.
HMF mg/kg = A x 192
A : Spektrofotometrede okunan absorbans
192 rakamı ise, deneyde oluşan renkli maddenin ekstinksiyon katsayısı ve sonuç için seçilen konsantrasyon birimi hesaba katılarak bulunmuş bir faktördür.
Kaynak : TS 3036 / Nisan 1991
